您好,欢迎访问上海恪瑞仪器科技有限公司
技术文章当前位置:技术支持>安捷伦二维液相色谱助力维生素 D 测定第四法

安捷伦二维液相色谱助力维生素 D 测定第四法

点击次数:211  发布时间:2021-05-11

安捷伦二维液相色谱精准助力应对 2020 版药典 0722 维生素 D 测定第四法

维生素 D 是人体所必须的脂溶性维生素。维生素D的基本作用是能促进钙和磷的吸收,缺乏维生素 D,会影响钙的吸收和骨代谢,最终引起佝偻病、软骨症或骨质疏松症等。作为药物的维生素 D 相关制剂是补充维生素 D 缺乏的最直接的途径。准确测定维生素 D 及其前体的含量,能够保证维生素 D 达到目标的效价,从而保证药物的有效性和安全性。

 

安捷伦二维液相色谱精准助力应对

 2020 版药典 0722 

维生素 D 测定第四法

2020 版药典 0722 新增维生素 D 测定第四法相关背景

维生素 D 测定的难点在于含维生素 A 醇及其他相应脂溶性杂质的供试品,如维生素 AD 软胶囊、滴剂等,其基质中存在大量油性辅料(大豆油)和维生素 A 醇的干扰,同时维生素 D2/D3 含量低(部分品种维生素 D2/D3 含量仅占 1‰ 左右) ,加上维生素 D 易受光热影响产生前维生素 D(pre-vitamin D)、反式维生素 D (Trans vitamin D)、速甾醇(tachysterol)和光甾醇(lumisterol)等。对于本类样品,2015 版药典和 2020 版药典的第二法和第三法,通常需要将样品进行皂化、有机溶剂液液萃取,结合反相色谱系统净化,最后再采用正相色谱系统进行定量检测。方法测定结果的准确性和重现性较难控制,也严重影响方法的分析效率。

 通过二维柱切换的液相色谱技术不仅可以提升系统分离能力,改善结构相似化合物的分离分析;同时可以通过第一维的初步分离去除样品基质中大量杂质成分干扰,实现样品净化。因此 2020 版药典 0722 维生素 D 测定新增了第四法即在线二维液相色谱法,方法第一维和第二维均采用正相色谱体系,其主要优点是样品可用正己烷溶解后直接进样分析,且具有载样量大,易去除非极性基质干扰成分,同时维生素 D 与其他羟基化的代谢物分离良好等优点。

安捷伦的应对方案

仪器系统的基本搭配如图 1 所示,整体上需要两套泵、一个两位六通切换阀、单或双紫外检测器组成。

 

主要色谱条件

色谱柱:

第一维:ChromCore VD-ChP4, 2.1*150mm,3μm(纳谱分析,货号S015-030012-02115S);

第二维:Zorbax Silica, 3.0*100mm, 1.8μm(Agilent Technologies,货号 828975-301);

流动相:第一维:A: 正己烷;B: 异丙醇; C: 正己烷:正戊醇:异丙醇 (98:1:1); 按下表进行梯度洗脱:

表 1. 第一维流动相梯度

 

第二维:正己烷:正戊醇:异丙醇=996:2:2;等度洗脱。

流速:0.5 mL/min;

柱温:40℃;

波长:265 nm;

阀切时间窗口:前维生素 D, 保留时间前后各 1.5min;维生素 D,出峰开始前和结束后各 1.5 min;Loop 环体积为 9 mL。

对照品和样品溶液按照《中国药典》2020 年版四部通则 0722 维生素 D 测定法第四法要求进行制备。

主要结果

1、对照品分析谱图

按照药典采用脲基修饰的 HILIC 色谱柱和正相体系作为第一维分离,结果前维生素 D 和维生素 D 的分离度为 9.8,维生素 D 的理论板数为 7600,完全满足系统适应性测试要求;目标物在第二维分离的峰对称性良好。

 

2、实际样品与对照品叠加谱图

由第一维的样品分离谱图可以看出,虽然维生素 D 分离良好,但前维生素 D 由于含量较低,易受到前面大量基质的干扰,通过柱切换方式将该目标组分切至第二维进行分离,能够对前维生素 D 实现无干扰分离分析。

 

小结

  • 通过二维柱切换法,能够有效去除样品基质干扰,改善前维生素 D 的分离,实现对前维生素 D 和维生素 D 的定量分析;

  • 本法对原有标准方法中 35~60min 的清洗过程进行适当调整,嵌入了强洗过程,既利于强保留化合物的快速洗脱(图 3 中 36-46min 色谱峰),缩减整体分析时间(由 80min 缩减到 65min),加快分析效率,也可避免潜在的强保留物质对后续分析造成影响,使第一维分离更稳定;

  • 由于流动相配制和色谱柱批次间的差异,需要适当调整维生素 D 在第一维色谱柱上的出峰时间在 25min 左右,同时通过对流动相比例的微调,可以使样品中含量较低且易受基质干扰的前维生素 D 在第二维中分离更好。

 

联系我们

contact us

咨询电话

13916002376

扫一扫,关注我们

返回顶部




扫一扫访问手机站扫一扫访问手机站
访问手机站